人血清单核细胞趋化蛋白1水平与脊柱结核易感性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.30.014

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (30): 5503-5510.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.30.014

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人血清单核细胞趋化蛋白1水平与脊柱结核易感性

郭超峰，张宏其，高琪乐，唐明星，刘少华，邓盎，王昱翔，鲁世金，李劲松，尹新华

中南大学湘雅医院脊柱外科，湘雅脊柱外科中心，湖南省长沙市 410008

收稿日期:2013-01-10 修回日期:2013-06-01 出版日期:2013-07-23 发布日期:2013-07-23
通讯作者: 张宏其，教授，博士生导师，主任医师，中南大学湘雅医院脊柱外科，湘雅脊柱外科中心，湖南省长沙市 410008 zhq9996@163.com
作者简介:郭超峰☆，男，1979年生，博士，主治医师，主要从事脊柱结核临床和基础研究。 343942471@qq.com
基金资助:
“中央高校基本科研业务费专项资金”资助项目(2012QNZT101)。

Serum monocyte chemoattactant protein-1 level and spinal tuberculosis susceptibility

Guo Chao-feng, Zhang Hong-qi, Gao Qi-le, Tang Ming-xing, Liu Shao-hua, Deng Ang, Wang Yu-xiang, Lu Shi-jin, Li Jin-song, Yin Xin-hua

Department of Spinal Surgery, Xiangya Hospital of Central South University, Xiangya Spinal Surgery Center, Changsha 410008, Hunan Province, China

Received:2013-01-10 Revised:2013-06-01 Online:2013-07-23 Published:2013-07-23
Contact: Zhang Hong-qi, Professor, Doctoral supervisor, Chief physician, Department of Spinal Surgery, Xiangya Hospital of Central South University, Xiangya Spinal Surgery Center, Changsha 410008, Hunan Province, China zhq9996@ yahoo.com.cn
About author:Guo Chao-feng☆, M.D., Attending physician, Department of Spinal Surgery, Xiangya Hospital of Central South University, Xiangya Spinal Surgery Center, Changsha 410008, Hunan Province, China 343942471@qq.com
Supported by:
Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. 2012QNZT101

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明单核细胞趋化蛋白1基因多态性与脊柱结核易感性相关。
目的：探讨湖南汉族人群血清趋化因子单核细胞趋化蛋白1表达水平与脊柱结核易感性的关系。
方法：连续纳入2004年12月至2010年12月中南大学湘雅医院收治的湖南汉族新发脊柱结核患者及健康志愿者，抽取受试者清晨空腹外周静脉血2 mL，应用PCR和DNA直接测序法检测受试者单核细胞趋化蛋白1-362位点的基因型，应用酶联免疫吸附试验检测受试者血清单核细胞趋化蛋白1水平。运用ROC曲线进行诊断性检验，计算血清单核细胞趋化蛋白1水平对脊柱结核的诊断阈值并分析诊断效价。
结果与结论：共纳入符合条件的脊柱结核患者208例，健康志愿者210名。脊柱结核患者血清单核细胞趋化蛋白1水平显著高于健康志愿者[(134.58±51.63) ng/L vs. (39.18±17.45) ng/L，P < 0.05]。且血清单核细胞趋化蛋白1水平不受性别影响，但在单核细胞趋化蛋白1-362-CC基因型人群中表达显著增高。当受试者血清单核细胞趋化蛋白1大于101.65 ng/L时，提示受试者可能已经罹患脊柱结核(敏感度：85.5%，特异度：94.3%，约登指数：0.799，ROC曲线下面积：0.946，95%可信区间：0.916-0.975，P < 0.01)。可见在湖南汉族人群中，血清单核细胞趋化蛋白1水平与脊柱结核的易感性相关，高表达的血清单核细胞趋化蛋白1可作为诊断脊柱结核的指标之一。

关键词: 骨关节植入物, 脊柱损伤基础实验, 细胞因子, 血清单核细胞趋化蛋白1, 基因多态性, 脊柱结核, 易感性, 炎症反应, 诊断, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: The monocyte chemoattactant protein-1 gene polymorphism is associated with spinal tuberculosis susceptibility.
OBJECTIVE: To investigate the association between serum monocyte chemoattactant protein-1 expression level and spinal tuberculosis susceptibility in Han population of Hunan province.
METHODS: The patients with spinal tuberculosis and the healthy volunteers were recruited in Xiangya Hospital of Central South University from December 2004 to December 2010. The empty peripheral venous blood 2 mL were collected from the subjects in early morning, then the monocyte chemoattactant protein-1-362 genotypes were detected by polymerase chain reaction and DNA sequencing technology. And the serum monocyte chemoattactant protein-1 level was detected by enzyme linked immunosorbent assay technology. The ROC curve was used for diagnostic tests to calculate diagnostic threshold value of serum monocyte chemoattactant protein-1 level to spinal tuberculosis susceptibility, and to analyze the diagnostic titer.
RESULTS AND CONCLUSION: 208 patients with spinal tuberculosis and 210 healthy volunteers were included. The serum monocyte chemoattactant protein-1 level of the spinal tuberculosis patients was significantly higher than that of the healthy volunteers [(134.58±51.63) ng/L vs. (39.18±17.45) ng/L, P < 0.01]. The serum monocyte chemoattactant protein-1 level could not be affected by gender, but over-expressed in patients with monocyte chemoattactant protein-1-362-CC genotypes. The serum monocyte chemoattactant protein-1 level higher than 101.65 ng/L indicated that the patients might suffered from spinal tuberculosis (sensitivity: 85.5%, specificity: 94.3%, Youden index: 0.799, area under curve of ROC: 0.946, 95% confidence interval: 0.916-0.975, P < 0.01). The serum monocyte chemoattactant protein-1 level may be associated with spinal tuberculosis susceptibility in Han population of Hunan province, highly expressed serum monocyte chemoattactant protein-1 can be used as one of the indicators for the diagnosis of spinal tuberculosis.

Key words: bone and joint implants, basic experiment of spinal cord injury, cytokines, serum monocyte chemoattactant protein-1, gene polymorphism, spinal tuberculosis, susceptibility, inflammatory response, diagnosis, other grants-supported paper

中图分类号:

R318

郭超峰，张宏其，高琪乐，唐明星，刘少华，邓盎，王昱翔，鲁世金，李劲松，尹新华. 人血清单核细胞趋化蛋白1水平与脊柱结核易感性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(30): 5503-5510.

Guo Chao-feng, Zhang Hong-qi, Gao Qi-le, Tang Ming-xing, Liu Shao-hua, Deng Ang, Wang Yu-xiang, Lu Shi-jin, Li Jin-song, Yin Xin-hua. Serum monocyte chemoattactant protein-1 level and spinal tuberculosis susceptibility[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(30): 5503-5510.

图/表（结果） 4

2.1 研究对象数量分析 研究共纳入208例脊柱结核患者和210名健康人，所有受试者均进入结果分析。
2.2 研究对象的基线资料 研究纳入的脊柱结核患者和健康人均为湖南地区汉族人群。经比较发现病例组和对照组间性别、年龄、吸烟情况差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.3 受试者单核细胞趋化蛋白1-362基因型分布情况 测序发现受试者单核细胞趋化蛋白1-362基因有GG、GC、CC 3种基因型，见图4-6。经检验发现两组受试者的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P > 0.05)。与对照组比较，病例组CC基因型频率显著增高(χ²=8.713，P=0.013)，见表3。

2.4 不同人群中血清单核细胞趋化蛋白1的表达水平 酶联免疫吸附试验结果显示，脊柱结核患者血清单核细胞趋化蛋白1水平显著高于健康人群[(134.58±51.63) ng/L vs. (39.18±17.45) ng/L，t=-4.38，P < 0.05]；男性受试者与女性受试者间血清单核细胞趋化蛋白1水平差异无显著性意义[(84.13±35.22) ng/L vs. (79.87± 40.66) ng/L，t=-0.532，P > 0.05]。

2.5 不同基因型受试者血清单核细胞趋化蛋白1的水平 单因素方差分析结果显示：不同单核细胞趋化蛋白1-362基因型人群血清单核细胞趋化蛋白1水平差异有显著性意义(F=5.225，P=0.008)。其中CC基因型人群血清单核细胞趋化蛋白1水平显著高于GC基因型人群(t=2.191，P=0.032)和GG基因型人群(t=3.161，P= 0.002)，但GC基因型人群和GG基因型人群之间血清单核细胞趋化蛋白1水平差异无显著性意义(t=1.158，P= 0.252)，见图7。

2.6 血清单核细胞趋化蛋白1水平对脊柱结核的诊断性检验 实验采用ROC曲线法对血清单核细胞趋化蛋白1水平进行诊断性检验。结果显示ROC曲线下面积为0.946(95%可信区间：0.916-0.975，P < 0.001)，诊断阈值为101.65 ng/L，即当受试者血清单核细胞趋化蛋白1水平>101.65 ng/L时，提示受试者可能已经罹患脊柱结核(敏感度：85.5%，特异度：94.3%，约登指数：0.799)，见图8。

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引言

材料方法

设计：临床病例-对照研究。

时间及地点：自2004年12月至2010年12月，在中南大学湘雅医院完成标本收集，在中南大学医学遗传学国家重点实验室完成检测和分析。

对象：

病例组：连续收集2004年12月至2010年12月中南大学湘雅医院收治的湖南汉族新发脊柱结核患者，术前影像学检查及血清学指标显示脊柱结核感染征象，见图1。术前肺部影像学显示无明显肺结核感染征象，见图2。排除其他肺外结核。术后病灶组织病理切片提示结核感染，见图3，病原学检查显示脓液抗酸染色阳性或脓液分离培养结核分枝杆菌阳性。

纳入标准：①湖南地区汉族患者。②年龄≥18周岁。③术后病理切片或病原学检查证实为脊柱结核。

对照组：连续收集2004年12月至2010年12月在中南大学湘雅医院体检中心体检的身体健康的湖南地区汉族人群。均经影像学检查排除肺结核、脊柱结核和其他肺外结核。

病例组和对照组合并下列情况之一者不纳入研究：①培养结果为耐药结核菌者。②罹患影响免疫状态疾病者，如感染、创伤、肿瘤等。③合并影响单核细胞趋化蛋白1表达的疾病者，如冠状动脉硬化性心脏病、银屑病等。④合并自身免疫性疾病或其他脏器结核病，或有此类病史者。⑤合并遗传性疾病、接受过脊柱手术者。⑥未进行过卡介苗接种者。⑦有结核接触史者。

共纳入符合要求的脊柱结核患者208例，其中男110例，女98例，年龄18-71岁，平均(40.31±17.79)岁。同时纳入同期健康人210名，其中男102名，女108名，年龄18-72岁，平均(41.35±13.12)岁。

研究取得所有受试者的知情同意，符合国务院颁布的《医疗机构管理条例》的相关要求。

脊柱结核患者及健康人基因及血清单核细胞趋化蛋白1水平检测所用试剂与仪器：

方法：

标本采集及基因组DNA的提取：用EDTAK2抗凝管抽取受试者清晨空腹肘正中静脉血2 mL，使用购自大连宝生物工程有限公司的全血基因组DNA快速提取试剂盒，提取白细胞基因组DNA。运用紫外分光光度仪测定DNA浓度，用双蒸水稀释至100 ng/L。

PCR扩增单核细胞趋化蛋白1基因：参照文献[7]合成引物，正向引物：5’-GAG CCT GAC ATG CTT TCA TCT A-3’；反向引物：5’-TTT CCA TTC ACT GCT GAG AC-3’。扩增片段大小为174 bp。PCR反应体系共10 μL，见表1。

PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，72 ℃延伸10 min，退火至4 ℃保存。

PCR产物测序及分析：将扩增的PCR产物统一送上海美吉生物技术有限公司进行纯化和测序。测序结果用DNASTR软件中的EditSeq、SeqMan程序分析。

酶联免疫吸附试验检测受试者血清单核细胞趋化蛋白1水平：用促凝采血管，抽取受试者清晨空腹肘正中静脉血5 mL，摇匀，迅速放入低温离心机中，4 ℃下，1 000 r/min离心10 min，取上清液至1.5 mL eppendorf管中，-80 ℃深低温冰箱保存。每集齐25个受试者的血清标本，则使用人单核细胞趋化蛋白1酶联免疫吸附试剂盒检测受试者血清单核细胞趋化蛋白1水平。使用酶标仪测定标准品和标本的光密度值，绘制标准曲线，计算标本浓度。

主要观察指标：受试者的单核细胞趋化蛋白1基因型分布及血清单核细胞趋化蛋白1的水平。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件建立数据库，所有数据实行双机输入，逻辑查错。运用t 检验或卡方检验对两组间一般情况进行均衡性比较。运用t 检验和单因素方差分析对各组间血清单核细胞趋化蛋白1水平进行比较。运用ROC曲线进行诊断性检验，计算血清单核细胞趋化蛋白1水平对脊柱结核的诊断阈值并分析诊断效价。正态变量以x(_)±s表示，风险因素估算其95%可信区间。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

单核细胞趋化蛋白1也称为单核细胞趋化与激活因子，是趋化细胞因子家族亚族的一个成员^[15]。单核细胞趋化蛋白1不仅是一种很强的单核细胞及巨噬细胞趋化因子^[16-18]，还是重要的单核细胞诱导和激活因子^[19-22]。在人体内，单核细胞趋化蛋白1能诱导单核细胞液中游离氧浓度的增加和呼吸爆发，从而加强单核细胞对胞内菌的杀灭作用；并且通过调节细胞表面黏附分子的表达和细胞因子的产生，进而介导细胞的迁移、吞噬和其他黏附依赖性功能^{[18, 23]}。在结核病患者中，无论是肺泡上皮细胞还是血液中的单核细胞、巨噬细胞、粒细胞，都能在前炎症因子干扰素γ、细菌脂多糖、白介素等诱导下，表达产生大量单核细胞趋化蛋白1^[24-27]。这有助于趋化单核细胞、CD8⁺和CD4⁺T细胞到达炎症区域并执行细菌吞噬和抗原提呈等功能。单核细胞趋化蛋白1还能通过与肿瘤坏死因子α的协同作用，共同调节巨噬细胞的活性，并影响肉芽肿的形成和对结核病灶的包裹。单核细胞趋化蛋白1的免疫学功能可密切影响结核菌在体内的致病过程及结核菌的体内播散过程，因此，单核细胞趋化蛋白1适时、适量的表达在脊柱结核特异性免疫中发挥着决定性的作用^[9^，^28]。过高表达的单核细胞趋化蛋白1则会限制单核细胞反应，通过诱导转化生长因子β的生成从而抑制T细胞功能及活性，并抑制白细胞介素12及干扰素γ的表达，进而选择性抑制Th1型免疫反应^[29]，降低免疫反应的严重程度，但同时也会影响肉芽肿的形成^[30]；过高表达的单核细胞趋化蛋白1也会使受体饱和而失去对配体的敏感性，令其浓度梯度发生改变导致单核细胞的趋化反应受到限制^[31]。同时血清单核细胞趋化蛋白1还可上调白细胞介素4转录活性^[32]，诱导Th0细胞转化为Th2型细胞^[33-35]，从而上调Th2型免疫反应，导致体内Th1型免疫反应进一步受到抑制^[36]。以上过程均可导致机体对结核病易感，并增加了结核菌在体内播散的风险。

国内外许多文献报道了结核患者血清单核细胞趋化蛋白1水平要显著高于正常人群^[37-39]。实验结果也显示：湖南地区汉族脊柱结核患者血清单核细胞趋化蛋白1水平显著高于正常人群。同时，课题组发现单核细胞趋化蛋白1在不同的研究中存在较大波动，考虑主要由于以下因素所致：①不同研究使用的酶联免疫吸附试剂盒不同，标本的保存手段、研究的人群也存在差异。②各研究中结核病患者病情的严重程度不一。在Peters等^[11]的报道中，初治结核患者和难治性结核患者的血清单核细胞趋化蛋白1水平显著增高，提示单核细胞趋化蛋白1可能与结核病的严重程度相关。Hasan等^[40]已证实：巴基斯坦结核病患者的血清单核细胞趋化蛋白1水平随着病情严重程度逐步升高，数值可波动在31.5-1 712 ng/L之间。由于实验中病例组全部为脊柱结核患者，病情严重程度远大于普通肺结核患者，因此检测出的病例组单核细胞趋化蛋白1水平均数值也相对较高。

世界卫生组织的统计结果表明^[41]，全球结核病患者男性约为女性的2倍；Lienhardt等^[42]在西非的多中心病例-对照研究中也发现男性结核病患者数量约为女性的2.03倍；国外还有许多文献也报道了男性比女性更容易罹患结核^[43-46]；国内陈伟等^[47]报道2004至2007年，浙江、广西、湖南、甘肃和黑龙江男性肺结核患者分别为女性的2.4，2.5，2.7，1.8和2倍。实验中也观察到男性脊柱结核患者人数略多于女性，但统计学分析并未显示病例组与对照组间男女比例存在明显差异，考虑这可能与实验的样本量较少有关；同时国内外针对结核患者性别比例的研究仍是以肺结核患者为主体，目前尚未有针对脊柱结核患者男女比例的相关研究，因此要明确脊柱结核患者与正常人群之间是否存在性别差异，可能还需要更多样本量的多中心研究。

进一步分析受试者的一般资料后发现：血清单核细胞趋化蛋白1水平在不同性别人群中均无显著性差异，但单核细胞趋化蛋白1基因多态性却能显著影响血清单核细胞趋化蛋白1表达水平。这与国内外的报道相符^{[13, 38, 48-50]}。单核细胞趋化蛋白1基因位于第17号染色体q臂上11.2区域^[51]，单核细胞趋化蛋白1启动子区基因的改变可增加三氨基酸环扩展蛋白家族PREP1和PBX2与单核细胞趋化蛋白1启动子的结合率，从而增加了单核细胞趋化蛋白1基因的转录活性，导致下游血清单核细胞趋化蛋白1的表达水平增高^[52]。已有多篇文献报道单核细胞趋化蛋白1基因多态性与脊柱结核易感性相关：Buijtels等^[14]在赞比亚人群的研究中发现，不同单核细胞趋化蛋白1基因型的人群感染肺结核的风险可相差2.8倍；Ben-Selma等^[53]在突尼斯人群中的研究发现拥有不同单核细胞趋化蛋白1基因型的人罹患肺结核或肺外结核的风险性可相差3.1倍；而课题组前期研究中也曾发现单核细胞趋化蛋白1-362-CC基因型的患者更容易罹患脊柱结核^[8]。实验中又发现单核细胞趋化蛋白1-362-CC基因型的受试者血清单核细胞趋化蛋白1水平较其他基因型高。因此，推测单核细胞趋化蛋白1-362-CC基因可能引起下游单核细胞趋化蛋白1蛋白表达水平增高而致机体对脊柱结核易感。

为了明确血清单核细胞趋化蛋白1的诊断阈值和诊断效价，实验采用ROC对血清单核细胞趋化蛋白1水平进行诊断性检验。研究结果显示当受试者血清单核细胞趋化蛋白1水平>101.65 ng/L时，提示受试者可能已经罹患脊柱结核(敏感度：71.1%，特异度：93.7%，约登指数：0.647)。可见诊断阈值的敏感度不高，这可能与结核病复杂的致病过程和单核细胞趋化蛋白1广泛的生物学功能有关^[15]。因此，使用此诊断阈值时需严格排除可能影响到单核细胞趋化蛋白1表达水平的疾病，并且使用相同的检测方法才能使诊断结果更具信度和效度。

人血清单核细胞趋化蛋白1水平与脊柱结核易感性

Serum monocyte chemoattactant protein-1 level and spinal tuberculosis susceptibility

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